盈信策略 文献分享：Fc突变调节IgG1抗体黏度

背景

在过去几十年中，抗体疗法在多种疾病的治疗中越来越普遍，包括癌症，炎症性，自身免疫等疾病。由于抗体疗法中通过皮下注射的方式，一般皮下注射的典型剂量（<2mL），这就需要高抗体浓度（>100mg/mL）来提供所需的抗体量。高抗体浓度可能会带来技术挑战，增加成本并延迟抗体疗法的发展。治疗性抗体的自缔合会导致粘度升高，从而给制造和配方带来问题，并限制皮下注射给药。一些抗体的高浓度粘度已通过可变域突变或添加配方赋形剂来降低。相反，Fc突变对抗体粘度的影响研究甚少。

2024年4月4日，Genentech公司的研究人员在MAbs上发表了一篇名为“Modulation of the high concentration viscosity of IgG1 antibodies using clinically validated Fc mutations”的文章。在这里，研究人员研究了一组常见且经过临床验证的Fc突变对两种密切相关的人源化IgG1，κ抗体，omalizumab（抗IgE）和trastuzumab（抗HER2）粘度的影响。发现某些IgG1抗体的高黏度可通过Fc突变缓解，这提供了一种方法，有助于设计未来可能适用于皮下给药的抗体疗法。

可变结构域，Fc区，IgG1格式对omalizumab和trastuzumab黏度的作用

可变区（尤其是CDR区）在omalizumab单抗的高粘度中发挥重要作用，在等效质量浓度下，omalizumab单抗相应的F(ab’)2的黏度降低了9.1倍，这表明Fc区域对该抗体的高粘度有显著贡献。相比之下，仅Fc片段的粘度非常低。这些结果表面Fab-Fc可能是omalizumab高粘度的重要促成因素。trastuzumab单抗的黏度明显依赖于完整的IgG1格式。

IgG自结合位点可能包括Fab-Fab、Fab-Fc和Fc-Fc相互作用，在自结合的四接触模型中，发现Fab-Fab和Fab-Fc（而非Fc-Fc相互作用）对omalizumab的高粘度做出了重大贡献。

Fc变异对omalizumab和trastuzumab单抗黏度的影响

研究了一些常用的Fc变体对omalizumab和trastuzumab高浓度黏度的影响，omalizumab中发现YTE（血清半衰期延长），NG（糖基化），LPLIL（效应功能增强）这3种Fc变异体分别使亲本抗体的黏度降低了10.7倍、2.2倍和1.6倍。

与omalizumab相比，Fc变异均未显著降低trastuzumab本已较低的黏度，相反一些Fc变异体增加了trastuzumab的黏度，表明临床阶段抗体中常用的Fc修饰有时可导致不必要的自结合。

Fc变体突变的空间定位与显著的粘度效应

研究人员发现了识别Fc中与自关联相关的拓扑区域，对于omalizumab，降低黏度的变体NG和LPLIL在上部CH2结构域具有溶剂可及的表面残基，以及在CH2和CH3结构域具有面向糖的残基。omalizumab最显著的降低黏度变异型YTE位于CH2/CH3肘部区域。该区域还包含LS突变的位置，LS突变是唯一发现粘度显著升高的omalizumab单抗Fc变异体。omalizumab中影响粘度的突变的空间取向与trastuzumab明显不同。已鉴定的所有显著增加trastuzumab粘度的变体都涉及替换位于上部CH2结构域的残基。

Omalizumab单抗的高黏度因个体YTE突变而得到缓解

通过评估YTE三重突变中所有可能的单一成分突变（M252Y、S254T和T256E）和双重成分突变（M252Y：S254T、M252Y：T256E和S254T：T256E），进一步研究了从YTE三重突变（176 cP到16.4 cP）中奥马珠单抗的黏度大幅降低。通过单个S254T（降低6.1倍）或T256E（降低5.8倍）突变，可以部分重现YTE三重突变导致的Omalizumab黏度大幅降低（10.7倍）。

溶液pH、静电和疏水性影响omalizumab的粘度

Omalizumab具有强pH依赖性，它的粘度在pH6.0时达到最大值，而在更酸性或更碱性的条件下粘度降低，这表明组氨酸的离子化状态可能对粘度有贡献。

通过添加赋形剂、NaCl和精氨酸-盐酸（Arg-HCl），研究了促进omalizumab高粘度的非共价相互作用类型。Nacl使omalizumab的粘度降低，表明它的静电相互作用被屏蔽。但是添加Nacl后，它的单抗YTE变体粘度增加，这意味着Fab-Fab自结合主要不是由静电驱动。Arg-HCl的加入降低了omalizumab的粘度。说明酸性和芳香族基团是通过Fab-Fc和Fab-Fab自关联增加粘度。

亲本和YTE Fc区的分子动力学分析

M252Y单突变体显示SAP评分大幅增加，相应的双突变体（M252Y：S254T和M252Y：T256E）和三突变体（YTE）的SAP评分增加较小，这一观察结果与在M252Y中观察到的显著粘度增加一致，表明酪氨酸在增强Fc区域的芳香性或疏水性方面发挥关键作用。点突变周围的静电表面APBS评分受到谷氨酸残基存在与否的显著影响。与亲本和其他变体（在Fc环上保持正静电电位）相比，单（T256E）、双（M252Y：T256E和S254T：T256E）和三（YTE）突变体均在指定环内表现出向负静电电位的转变。

考虑了不同变体中集合平均静电和疏水（SAP）表面特性的变化，所有具有谷氨酸突变的变体都表现出向局部 Fc 区负表面电位的转变，这与观察到的粘度降低一致。

Fc的不稳定可能有助于降低omalizumab的粘度

分析每个变体的Fc区相对于不同MD框架的初始亲本晶体结构的均方根偏差（RMSD），了解Fc点突变如何影响Fc区的结构和构象稳定性。发现亲本Fc相对于晶体结构的环RMSD最低，YTE三重突变体表现出最显著的构象变化和不稳定性，其次是M252Y:T256E双突变体。其他突变体，无论是谷氨酸还是酪氨酸取代，也显示出与亲本Fc相比在相应环内更高的RMSD不稳定性。S254T变体也显示出与亲本Fc相比增强的不稳定性，尽管它低于其他变体。Fc的不稳定可能会通过增加Fab-Fc相互作用的熵成本来破坏分子间相互作用。

MD分析揭示了YTE突变导致Fc不稳定的潜在机制，YTE突变会破坏Fc区域中的一个稳定的分子内盐桥网络。在野生型Fc中，R255、K246和K248这些带正电荷的氨基酸形成一个稳定的网络，将带负电荷的D249包裹其中。而YTE突变引入的Y252和E256会与这些带正电荷的氨基酸形成新的分子内相互作用，打破了这个稳定的网络结构。YTE突变导致Fc区域出现多种有利的构象，表现出较大的构象不稳定性。与野生型Fc相比，YTE 变体在MD模拟中显示出更大的均方根偏差（RMSD）。这种构象不稳定性可能会影响Fab-Fc之间的相互作用，从而降低抗体的高浓度粘度。

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